Emfret产品授权Emfret代理靶点科技现货表

货号	产品名称	规格
M011-0	mouse GPVI	0.1mg
M011-1	mouse GPVI	1.5mL
M025-0	Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61)	0.5mg
M025-1	Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61)	1.5mL
M025-2	Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61)	1.5mL
M025-3	Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61)	1.5mL
M021-0	Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61)	0.5mg
M021-1	Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61)	1.5mL
M022-0	Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61)	0.5mg
M023-2	Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61)	1.5mL
M024-0	Integrin alphaIIb (GPIIb, CD41)	6mg
M030-0	Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61)	0.5mg
M031-0	Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61)	0.5mg
M031-1	Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61)	1.5mL
M040-0	GPIbalpha (CD42b)	0.5mg
M040-1	GPIbalpha (CD42b)	1.5mL
M040-2	GPIbalpha (CD42b)	1.5mL
M040-3	GPIbalpha (CD42b)	1.5mL
M041-0	GPIbalpha (CD42b)	0.5mg
M041-1	GPIbalpha (CD42b)	1.5mL
M042-0	GPIbalpha (CD42b)	0.5mg
M042-1	GPIbalpha (CD42b)	1.5mL
M043-0	GPIbalpha (CD42b)	0.5mg
M043-1	GPIbalpha (CD42b)	1.5mL
M050-0	GPIbbeta (CD42c)mouse and human	0.5mg
M050-1	GPIbbeta (CD42c)mouse and human	1.5mL
M051-0	GPIX (CD42a)	0.5mg
M051-1	GPIX (CD42a)	1.5mL
M060-1	GPV (CD42d)	1.5mL
M061-0	GPV (CD42d)	0.5mg
M061-1	GPV (CD42d)	1.5mL
M070-0	Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa)	0.5mg
M070-1	Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa)	1.5mL
M071-0	Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa)	0.5mg
M071-1	Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa)	1.5mL
M080-0	Integrin alpha5 chain (CD49e)mouse and human	0.5mg
M080-1	Integrin alpha5 chain (CD49e)mouse and human	1.5mL
M110-0	CD9	0.5mg
M110-1	CD9	1.5mL
M120-0	CD31 (PECAM-1)	0.5mg
M130-0	CD62P (P-selectin)	0.5mg
M130-1	CD62P (P-selectin)	1.5mL
M130-2	CD62P (P-selectin)（靶点科技现货）	1.5mL
P150-1	von Willebrand Factor (vWF)	1.5mL
P140-1	fibrinogen	1.5mL
P180-1	negative control	1.0mL
P190-1	negative control	1.0mL
P190-2	negative control	1.0mL
P190-3	negative control	1.0mL
R300	Antibodies for Mouse Platelet Depletion（靶点科技常年现货）	0.5mg
C301	Antibodies for Mouse Platelet Depletion	0.5mg
D200	Two-Color Analysis of Mouse Platelet Activation（靶点科技现货）	2.0ml
X488	In Vivo Mouse Platelet Labeling	0.1mg
X649	In Vivo Mouse Platelet Labeling	0.1mg

抗体相关实验技术Protocols

一、小鼠血小板表面糖蛋白的流式细胞术分析

缓冲液和试剂准备：

Tris缓冲盐水/肝素（TBS/Hep）：20mM Tris/HCl；137mM NaCl；pH 7.3；含有20U/ml肝素。

磷酸盐缓冲液（PBS）：137mM NaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH₂PO₄；8mM Na₂HPO₄；pH 7.14。

改良台氏液/改良Tyrode''s溶液：134mM NaCl；0.34mM Na₂HPO₄；2.9mM KCl；12mM NaHCO₃；20mM Hepes；pH 7.0；5mM葡萄糖；0.35%（w/v）牛血清白蛋白。

腺苷三磷酸双磷酶Apyrase：溶于水（10 U/mL），在-20°C下储存。

前列环素Prostaglandin（Prostaglandin 2, PGI2）：溶于水（1 mM），在-20°C下储存。

CaCl₂：1 M溶于水。

稀释或洗涤全血的制备：

1、用肝素化玻璃毛细管（如环帽）从眶后神经丛抽取50µL血液，放入1.5 ml含有200µLTris缓冲盐水/肝素（20 U/ml）的试管中。

2、在1 mL Tyrode缓冲液中稀释，用于流式细胞仪分析。

3、为了制备洗涤过的血液，将稀释的血液以900 x g离心5分钟，去除上清液，并将沉淀重悬在1.25 mL Tyrode缓冲液中。

4、在实验开始前直接加入1mM CaCl₂。

注：对于凝血酶诱导的血小板活化，必须去除血浆以防止抗凝血酶活性。

血小板制备：

1、制备洗涤过的血小板是一种更耗时的方法，需要大量的血液，但产生的血小板制剂可以使用数小时。

2、用1.5 cm玻璃毛细管从眶后丛收集0.5-1 mL血液，放入含有200 µL TBS/肝素（20 U/ml）的1.5 mL管中。去除含有一些红细胞的上清。

3、以500 x g离心样品5分钟，并将富含血小板的血浆（PRP）转移到新的试管中。

4、将血小板悬浮液以300 x g离心8分钟，并将不含任何红细胞的PRP转移到新的试管中。

5、加入0.5 µM前列环素（PGI2），以1300 x g离心5分钟。

6、将血小板颗粒重新悬浮在1 mL Tyrode缓冲液中，加入0.02 U/mL腺苷三磷酸双磷酶和0.5 µM前列环素，在37℃下孵育5分钟，并在1300 x g下离心5分钟。

7、重复步骤5，将血小板颗粒重悬于0.5 ml Tyrode缓冲液中，加入0.02 U/mL腺苷三磷酸双磷酶，并在37℃下孵育30分钟。

血小板表面糖蛋白的单色分析：

1、将5 µL特异性或阴性对照抗体和25 µL稀释的全血在分析管中混合，涡旋混匀1-2秒。

2、在室温下孵育15分钟。

3、加入400 µL PBS停止反应，并在30分钟内进行分析。

如所述，将样品与FITC缀合的对照IgG（黑线）、GPVI抗体或GPV抗体孵育。血小板通过前向散射（FSC）/侧散射（SSC）血小板通过前向（FSC）/侧向（SSC）散射特征进行筛选。在单独的直方图中显示了被筛选（R1）的血小板的荧光（FL1）强度。RBC：红细胞。

血小板活化的双色分析：

1、将5 µL特异性或阴性对照抗体与5 µL泛血小板标记物一起加入测定管中。

2、此时，加入小体积（<5 µL）的任何额外的试剂（如抑制剂）。

3、加入26 µL稀释的全血或经洗涤过的血小板（100万），涡旋混匀1-2秒。

在室温下孵育15分钟。加入400 µL PBS停止反应，并在30分钟内进行分析。

小鼠血小板分别与PBS或0.1U/mL的凝血酶（thrombin）一起与FITC和PE结合的mAbs一起孵育。通过GPIX或GPIIbIIIa（FL1; gate 1）的表达对血小板进行了筛选。

二、免疫组织化学（用丙酮固定冷冻切片）

请注意：不建议在（对）甲醛固定的样本上进行免疫组织化学染色，因为大多数大鼠抗体在这些条件下对小鼠组织的效果很差。

1、将冷冻组织的切片放在玻片上，并在4°C下的冰冷100%丙酮中固定20分钟。在室温下干燥一整夜。

2、为了减少试剂的用量，在玻片上的组织切片周围可以用防水笔画一个疏水圈。在所有后续的步骤中，这个圈起来的区域都不应该干燥。因此，建议在潮湿的盒子中进行孵育步骤。

3、在PBS中孵育玻片20分钟。

4、使用过氧化物酶结合的二抗时，将玻片在室温下与0.03%的H₂O₂孵育10分钟以抑制内源过氧化物酶活性。在PBS中三次洗涤玻片，每次5分钟。

5、用PBS稀释（比例1:10或1:100）的封闭液（二抗体宿主物种的血清），室温下孵育玻片1小时。

6、一抗（2-10 µg/ml）室温孵育2小时。

7、吸取多余液体，然后在PBS中洗涤三次，每次5分钟。

8、用荧光素或过氧化物酶结合的二抗（例如：亲和纯化的驴抗大鼠IgG-FITC或HRP）覆盖玻片，按照说明书在封闭液中稀释，室温下孵育1小时。

9、吸取多余液体，PBS洗涤三次，每次5分钟。

10、荧光染色的样本可以直接通过荧光显微镜分析。

11、为了可视化过氧化物酶标记的组织，用新鲜制备的3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）底物覆盖玻片，并在显微镜下可见红色染色，时间可在5至30分钟之间变化。在橙色背景染色出现之前，用去离子水冲洗停止反应。用伊红染色30-240秒，然后在温水中冲洗玻片20分钟。使用水溶性封装溶液固定切片。

三、免疫沉淀

缓冲液和试剂准备：

PBS/EDTA：137mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM KH₂PO₄、8.0mM Na₂HPO₄ x 2H₂O，pH 7.3；5 mM EDTA。

IP缓冲液：40 mM Tris/HCl、0.3 M NaCl、1 mM EDTA、2 mM PMSF、10µg/mL Leupeptin蛋白酶抑制剂、10µg/mL Aprotinin抑肽酶、1µg/mL Pepstatin胃蛋白酶抑制剂。

Igepal非离子表面活性剂：10%的H₂O溶液。

2x SDS样品缓冲液：10%β-巯基乙醇（用于还原缓冲液）、10%Tris缓冲液（1.25 M）、20%甘油、4%SDS、0.02%溴酚蓝。

1、将小鼠血小板或细胞在1 mL PBS/EDTA（5分钟，1300 x g）中洗涤3次，并使用IP缓冲液重悬。

2、加入1%Igepal 在室温下溶解血小板（15–20分钟）。

3、10000 x g下离心5分钟去除细胞碎片，并将上清液转移到新的试管中。

4、加入20µL洗涤过的protein G agarose（PGA）。在4°C下混匀孵育至少3小时。

5、3000 x g离心样品5分钟。将上清液转移到新的试管中，以说明书中给定的浓度（通常在2-5µg/mL之间）加入抗体，30分钟后加入25µL洗涤过的PGA。在4°C下混匀孵育至少2小时，最好过夜。

6、将样品在3000 x g下离心1分钟，向PGA中加入1 mL含有1%Igepal的1 x IP缓冲液。在3000 x g下离心1分钟。

7、用IP缓冲液中洗涤PGA两次（3000 x g离心1分钟）。

8、加入25µL 1x SDS样品缓冲液（还原或非还原），将PGA重悬，煮沸5分钟。9、然后将样品冷冻（-20°C）以备日后使用，或者进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。

四、免疫印迹分析（Western Blot Analysis）

缓冲液和试剂准备：

裂解缓冲液：40mM Tris/HCl、0.3M NaCl、1mM EDTA、0.05%NaN₃、1%Igepal。

PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.5 mM KH₂PO₄、8.0 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O，pH 7.3。

5%脱脂牛奶-PBS：含5%脱脂奶粉的PBS。

PBS/T：PBS含0.1%吐温20。

1%脱脂牛奶-PBS/T：含1%脱脂牛奶的PBS/T。

所有步骤都可在室温下进行：

1、在裂解缓冲液中制备小鼠血小板或细胞的裂解物，并与（2x）SDS样品缓冲液在95°C下孵育5分钟。

2、根据说明书，在还原或非还原条件下，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，并将蛋白质转移到PVDF膜上。

3、用5%脱脂牛奶封闭膜1小时。

4、加入PBS/T-1%牛奶稀释的一抗（2-5µg/mL），孵育1小时。

5、用PBS/T冲洗膜两次，30分钟。洗涤程序可以减少到三次，每次10分钟。

6、加入PBS/T-1%牛奶稀释的二抗（HRP偶联的抗大鼠Ig），孵育45-60分钟。

7、用PBS/T冲洗膜两次，30分钟。

8、使用ECL（化学发光）显色。

Emfret热卖产品